Синтез генома бактериофага N4

В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры.

Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4.

Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры. Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4. Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток V. cholerae. Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома. Ключевые слова: холера, бактериофаг, синтез генома.

Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома.