Разработка ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в культурах клеток млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций

Обоснование. Исследования экспрессии генов в клетках животных-хозяев зоонозных инфекций необходимы для понимания механизмов взаимодействия патогена и хозяина и способов существования патогенов в природе. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-рвПЦР) – один из наиболее надёжных и доступных современных методов сравнительного изучения экспрессии генов, поэтому подбор эндогенных стандартов (референтных генов) для нормализации результатов ПЦР является необходимым этапом исследования.

Цель исследования. Разработка ОТ-рвПЦР для выявления транскриптов (матричной РНК (мРНК)) генов субъединицы А сукцинатдегидрогеназы (SDHA) и бета-актина (ACTB) в культурах клеток млекопитающих – хозяев зоонозных инфекций.

Методы. Культуры клеток почки восточноазиатской лесной мыши ApnK и почки эмбриона свиньи СПЭВ выращивали в 24-луночных планшетах. Монослои клеток открепляли трипсином и выделяли суммарную РНК/ДНК. Геномную ДНК удаляли ДНКазой I, свободной от РНКаз. Далее проводили одностадийную ОТ-рвПЦР с использованием разработанных наборов праймеров и соответствующих гидролизуемых зондов TaqMan к SDHA и ACTB. Эксперимент проводили в четырёх независимых воспроизведениях.

Результаты. При детекции мРНК гена ACTB в обеих культурах клеток и гена SDHA в культуре СПЭВ линейность, эффективность, повторяемость и воспроизводимость теста соответствуют современным требованиям к ОТ-рвПЦР. Детекция мРНК SDHA в клетках ApnK отвечает требованиям к линейности и эффективности реакции, однако повторяемость (CV = 2,7 %) и воспроизводимость (CV = 5,8 %) теста несколько превышают рекомендуемые пределы. Для использования этого гена в качестве референтного требуется исследовать особенности экспрессии SDHA в клетках ApnK.

Заключение. Разработана методика ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в клетках восточноазиатской лесной мыши (A. peninsulae) и свиньи (S. scrofa). На следующем этапе исследования необходимо валидировать эти гены в качестве референтных для количественной оценки экспрессии генов млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций в норме и при патологии.