Применение зимографического и протеомного анализа для идентификации внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов Vibrio cholerae

Целью работы является применение зимографического и протеомного анализа для изучения состава и функций внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов Vibrio cholerae 569В серовара Инаба и М41 серовара Огава.

Материалы и методы. Образцы внутриклеточных протеаз получали из клеточных лизатов путем обработки бактериальных клеток ультразвуком в 9 М растворе мочевины. Фракцию экстрацеллюлярных протеаз осаждали из культуральной жидкости добавлением 50 % трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 10 % и инкубацией на льду. В качестве контроля протеолитической активности использовали лиофилизированные препараты протеиназы К и ферментного комплекса протеовибрина. Протеазы выявляли методом субстратного гель-электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле, импрегнированном 0,1 % желатином с последующей идентификацией состава белковых фракций лизатов и экзопротеинов обоих штаммов с помощью молекулярного масс-спектрометрического сканирования.

Результаты и обсуждение. Сравнительное исследование производственных штаммов V. cholerae 569В серовара Инаба и М41 серовара Огава с помощью зимографического и протеомного анализа показало, что наибольшая ферментативная активность выявлена в образце фракции экстрацеллюлярных протеаз штамма V. cholerae М41, где идентифицировано пять основных и четыре минорных зоны гидролиза желатина, причем зоны высокой интенсивности с МW 20–23 и 37‒40 кДа обнаружены также в препарате протеовибрина, выделенного из культуральной жидкости этого штамма. В результате протеомного анализа исследуемых штаммов достоверно идентифицированы 66 ферментов V. cholerae с различной функциональной активностью, среди которых 15 ферментов обладали протеазной активностью. Высокая информативность комплекса современных методов показала возможность выявления качественных и количественных различий состава внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов V. cholerae, что предлагает эффективное средство скрининга межштаммовых различий протеазного спектра у производственных штаммов.