Поиск генетических маркеров вируса клещевого энцефалита для его специфичной индикации

Цель исследования – анализ генетических маркеров вируса клещевого энцефалита, которые можно использовать для специфичной индикации максимально большего числа штаммов и изолятов вируса.

Материалы и методы. В качестве амплифицируемого материала использовалась плазмидная ДНК и нуклеиновые кислоты клещей рода Ixodes и Dermacentor. Полимеразную цепную реакцию осуществляли на амплификаторе «C1000» с оптическим блоком «CFX96» (BioRad). Видовое (штаммовое) разнообразие выявляемых с применением анализируемых генетических маркеров организмов определяли в программной утилите «nBLAST». Дизайн нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов проводили, используя программу «Vector NTI 9.1.0» (Invitrogen Corporation). Выделение нуклеиновых кислот производили методом магнитной сорбции с комплектом реагентов «МАГНО-сорб». Праймеры и зонды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Для ПЦР использовались реактивы производства ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

Результаты и обсуждение. При индикации генома вируса клещевого энцефалита основным критерием выбора маркерной последовательности является специфичное выявление нуклеиновых кислот только искомого микроорганизма. Для поиска специфичной маркерной нуклеотидной последовательности произведен анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей различных штаммов и изолятов вируса клещевого энцефалита. Взаимное сравнение всех указанных выше геномов позволило определить семь условно консервативных локусов, характеризующихся минимальной вариабельностью нуклеотидов. Опираясь в дальнейшей работе на результаты выравнивания нуклеотидных последовательностей изолятов вируса клещевого энцефалита, в том числе учитывая нуклеотидные последовательности гетерогенных микроорганизмов, выполнен дизайн праймеров и зондов для амплификации каждого из маркерных локусов, наиболее аналитически значимые олигонуклеотиды разработаны на основе локусов 4 и 7. Амплификация с олигонуклеотидными затравками для индикации вируса клещевого энцефалита была результативной как в отдельной ПЦР с положительным контролем, так и в сочетании с ДНК клещей.