Модификация протокола исследования функциональной активности оттаявших после криоконсервации Т-лимфоцитов

Обоснование. Иммунологические исследования невозможны без длительного хранения биоматериала в условиях криоконсервации. Стандартные методики работы с мононуклеарными лейкоцитами, подвергавшимися криоконсервации, отсутствуют.

Цель исследования. Оптимизировать протокол культивирования оттаявших после криоконсервации Т-лимфоцитов по оценке их жизнеспособности и пролиферативной активности.

Методы. Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови относительно здоровых добровольцев (n = 18). Клетки подвергали контролируемому замораживанию до –80 °С и переносили в жидкий азот. Первый этап: после оттаивания клетки окрашивали CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), делили на две части и культивировали в присутствии/ отсутствии интерлейкина 2 (ИЛ-2). Пролиферацию клеток стимулировали фитогемагглютинином-П. Клетки инкубировали в течение 7 суток. Анализ образцов проводили методом проточной цитофлюориметрии. Второй этап: оттаявшие клетки делили на три части. Две части ресуспендировали в полной питательной среде с ИЛ-2 и помещали в термостат (+37 °С) для «отдыха» на 1 час или на ночь. После «отдыха» клетки окрашивали CFSE. Третью часть размороженных лейкоцитов окрашивали CFSE сразу после оттаивания. Клетки стимулировали, культивировали и анализировали единообразно на обоих этапах исследования.

Результаты. Установлено, что добавление ИЛ-2 в культуральную среду способствует лучшему выживанию клеток. Кроме того, в присутствии ИЛ-2 стимулированные CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты производят больше дочерних генераций. По сравнению с пробами, сразу помещёнными в культуру, в пробах, прошедших «отдых», снижено число лейкоцитов по окончании 7-суточной инкубации. Количество дочерних генераций, формируемых стимулированными CD4+ и CD8+ Т-клетками, снижается при включении этапа «отдых» в протокол исследования.

Заключение. Внесение ИЛ-2 в культуральную среду может увеличить жизнеспособность и митотическую активность размороженных Т-клеток, приближая их состояние к таковому свежевыделенных лимфоцитов. «Отдых» клеток после оттаивания оказывает негативный эффект на жизнеспособность и пролиферативную активность Т-лимфоцитов при их последующей недельной инкубации.