Клонирование гена метионин-аминопептидазы бактерии Thermus thermophilus и подтверждение функциональной активности фермента

Обоснование. Метионин-аминопептидазы (МАП) – это класс ферментов, которые катализируют удаление N-концевого инициирующего метионина из полипептидной цепи. Бактериальные МАП рассматриваются в качестве мишеней для разработки антибактериальных препаратов широкого спектра действия, а применение МАП в биотехнологии обуславливает поиск новых МАП, исследование механизмов их функционирования и ингибирования.

Цель исследования. Идентификация метионин-аминопептидазы в геноме Thermus thermophilus (Tt-МАП) и подтверждение её функциональной активности.

Материалы и методы. Для идентификации Tt-МАП был проведён анализ генома Thermus thermophilus в базе данных GeneBank. Для клонирования в векторе pHUE предполагаемой открытой рамки считывания (ОРС), кодирующей Tt-МАП, были использованы современные методы генной инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, трансформация, гетерологичная экспрессия). Для получения очищенного препарата фермента были использованы различные методы хроматографии (аффинная, ионообменная и эксклюзионная). Для подтверждения специфической функциональной аминопептидазной активности фермента использовали флюорогенный субстрат L-метионин 7-амино-4-метилкумарин (Met-AMC).

Результаты. В геноме бактерии Thermus thermophilus идентифицирована ОРС, кодирующая МАП. На основании нуклеотидной последовательности были составлены олигонуклеотидные праймеры. ОРС клонирована в векторе, и проведена наработка рекомбинантного фермента в клетках E. coli. С использованием ряда последовательных хроматографий разработана методика очистки фермента до гомогенного состояния, позволяющая получать до 30 мг с 1 л культуры. С использованием флюорогенного субстрата Met-AMC была показана специфическая функциональная активность фермента (фермент отщепляет метионин от субстрата).

Заключение. Нами проведена идентификация МАП Thermus thermophilus и проверка её функциональной активности. Показано, что продукт ОРС TTHA1670 кодирует специфичную к метионину аминопептидазу, т. е. метионин-аминопептидазу. Фермент может быть использован в различных отраслях биотехнологии и научных исследованиях.