Исследование стабильности штамма-продуцента анальгетического пептида HCRG21

Разработка новых, более эффективных обезболивающих препаратов, обладающих высоким сродством к биологическим мишеням, является актуальной задачей. Кандидатом для разработки нового анальгетического препарата стал пептид HCRG21 морской анемоны Heteractis magnifica – блокатор TRPV1-канала.

Цель исследования. Провести исследование генетической и экспрессионной стабильности штамма Escherichia coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21, продуцирующего гибридный белок SMT3_HCRG21.

Материалы и методы. Жизнеспособность клеток рабочей посевной культуры (РПК) при последовательных пассажах оценивали путем расчета титра клеток в каждом пассаже. Количество генераций РПК определяли на основании значений титра жизнеспособных клеток для каждого пассажа по соответствующей формуле. Уровень экспрессии гибридного белка в последовательных пассажах клеток был рассчитан посредством отношения количества гибридного белка к общему белку клеточного лизата. Содержание белка определяли по методу Лоури и с помощью электрофореза. Методами ПЦР и электрофоретического разделения определяли размер участка ДНК, кодирующего гибридный белок SMT3_HCRG21, а также проводили секвенирование по Сэнгеру для подтверждения подлинности вставки.

Результаты. Показано, что при последовательных пересевах титр клеток варьирует от 8,3·107 до 1,7·109 клеток/мл, а среднее число генераций составило 10,4 ± 2,3. В результате амплификации пДНК клонов 10, 90 и 140 генераций были получены фрагменты длиной около 600 н.п., что соответствует длине нуклеотидной последовательности генетической конструкции pSMT3_HCRG21 (541 н.п.). Нуклеотидные последовательности полученных ПЦР-фрагментов оказались полностью идентичны заявленным в паспорте штамма-продуцента. Продемонстрировано, что среднее содержание гибридного белка между генерациями сохранялось на уровне 16 %, что свидетельствует о высокой стабильности уровня продуктивности штамма.

Заключение. Биосинтетическая активность и количество жизнеспособных клеток штамма E. coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21 остаются стабильными, таким образом, штамм может быть использован для производства анальгетического пептида HCRG21.