Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл

Цель исследования – оценка эффективности анализа кривых плавления высокого разрешения, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовали 16 штаммов бруцелл видов Brucella canis (n=1), B. abortus (n=9), B. melitensis (n=2) и B. suis (n=4) различного географического происхождения. MLVA-типирование проводили методом классической ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле и методом ПЦР-РВ с пост-амплификационным анализом кривых плавления VNTR-локусов в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen. Биоинформационный анализ выполняли с помощью программ Vector NTI 9.1 и Mega 11 (алгоритм MUSCLE). Филогенетический анализ проводили методом UPGMA с помощью программы Mega 11.

Результаты и обсуждение. С помощью MLVA-подхода, основанного на анализе кривых плавления ПЦР-продуктов, полученных после амплификации VNTR-локусов, показано, что каждый из 16 штаммов бруцелл характеризуется уникальным профилем температур плавления. Методом ПЦР с последующим электрофорезом установлено, что, несмотря на высокую вариабельность использованных VNTR-последовательностей (h=0,48…0,74), только пост-амплификационные кривые плавления локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 обладали достаточной информативностью для определения генетического полиморфизма исследованных штаммов бруцелл. На основании филогенетического анализа последовательностей Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 показано, что большинство исследуемых штаммов бруцелл распределялись на дендрограмме в соответствии с их таксономическим и географическим положением. Таким образом, HRM-анализ кривых плавления, полученных после амплификации локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21, имеет потенциал использования для дифференциации штаммов бруцелл.