Разработка способа определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени

Цель исследования – разработка методического подхода для определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. 

Материалы и методы. В работе использовали 16 штаммов B. suis различных биоваров, по 2 шт. – B. neotomae и B. canis. Определение таксономической принадлежности штаммов бруцелл осуществляли по протоколам Bruce-ladder, Suis-ladder, БРУ-ДИФ. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRanner 6.5.52. Фрагментное секвенирование по Сэнгеру осуществляли на генетическом анализаторе 3500 XL в соответствии с рекомендациями производителя. Оценку гомологии нуклеотидных последовательностей проводили по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. 

Результаты и обсуждение. У штаммов B. suis различных биоваров проведен анализ структурной организации геномных островов IncP и GI-3. Установлено, что у штаммов 2, 4 биоваров B. suis и B. canis в результате гомологичной рекомбинации в геномном острове IncP утрачена концевая часть гена BRA0368, включающая 21 нуклеотид (повторяющийся в гене BRA0367) и стоп-кодон TAA, а также практически полностью последовательность гена BRA0367. Прямой повтор из 21 нуклеотида и стоп-кодона TGA гена BRA0367 заместил аналогичную область гена BRA0368, что привело к образованию делеции размером 185 п.н. В структуре GI-3 отличий у биоваров отмечено не было. Полученные результаты позволили разработать подход (Suis-ДИФ) для дифференциации биоваров B. suis, основанный на амплификации генов, расположенных в геномных островах IncP и GI-3, методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Подтверждена его специфичность при исследовании штаммов B. suis из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Проведенные исследования расширяют и дополняют сведения о генетической неоднородности видов и биоваров бруцелл. Предложенный способ определения биоваров B. suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени расширяет возможности идентификации бруцелл с помощью молекулярно-генетических методов.