Рекомбинантный штамм Escherichia coli с повышенной продукцией нейраминидазы Vibrio cholerae

Целью работы явилось клонирование гена nanH Vibrio cholerae в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем т5-промотора, и создание штамма E. coli – продуцента рекомбинантной нейраминидазы.

Материалы и методы. Донором ДНК послужил штамм V. cholerae о1, векторной плазмидой – pQE30. Ген амплифицировали с помощью пцр, клонирование осуществляли общепринятыми методами, продуктивность рекомбинантов и локализацию искомого белка определяли по результатам электрофореза лизатов клеток. Нейраминидазную активность определяли по наличию флуоресценции в ультрафиолетовом свете после инкубации со специфическим субстратом (4-метилумбеллиферил-N-ацетилнейраминовой кислотой). результаты и обсуждение. Сконструирована рекомбинантная плазмида pNanH, содержащая ген nanH V. cholerae, встроенный по сайтам BamHI-PstI в полилинкер pQE30. Экспрессия клонированного гена в штамме-продуценте E. Сoli JM103pNanH происходит под контролем т5-промотора при индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (иптг). Штамм обладает нейраминидазной активностью. рекомбинантный белок NanH накапливается в клетках продуцента в двух формах. первая, с молекулярной массой (мм) 89,5 кда, представляет собой непроцессированный белок с гексагистидиновым блоком (6His-tag) на N-конце и находится в тельцах включения. Ее содержание составляет 5,6–6,6 % суммарных клеточных белков. вторая, с мм 83 кда, обнаруживается в периплазматическом пространстве клеток и соответствует зрелой NanH, содержание составляет 3,4–3,8 %. Их общее содержание – 9–10 % суммарных клеточных белков, что позволяет считать штамм E. coli JM103pNanH суперпродуцентом искомого фактора. Штамм может быть использован для получения NanH V. cholerae в целях создания специфических диагностических, терапевтических и фармацевтических препаратов, а также для изучения свойств этого белка как фактора патогенности/персистенции возбудителя.