Внутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени

Цель – разработка способа внутривидовой дифференциации туляремийного микроба: подвиды tularensis (субпопуляции AI и AII), holarctica (биовары japonica, EryS/R), mediasiatica и novicida – с помощью мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Материалы и методы. В работе использовали 48 штаммов Francisella tularensis различных подвидов, биоваров и субпопуляций. Внутривидовую принадлежность штаммов устанавливали на основании анализа вариабельности области дифференциации RD-1 методом ПЦР , гена sdhA – методом фрагментного секвенирования по Сэнгеру, диско-диффузионным методом с использованием дисков с эритромицином. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRunner 6.5.52. Оценку гомологии последовательностей – по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. Результаты и обсуждение. Получены новые данные по структуре и встречаемости областей дифференциации RD-8, RD-12, RD-28, гена FTT1122с и гомологичных ему последовательностей у штаммов туляремийного микроба различной подвидовой принадлежности. Выявлена новая RDhm размером 346 п.н., характерная для штаммов subsp. mediasiatica, holarctica, которая делетирована у subsp. tularensis и отсутствует у subsp. novicida. На основе выявления локусов FTT1670, FTT1122с, FTT1067, FTW_2084 разработана мультилокусная ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени «F. tularensis 4c», обеспечивающая определение всех подвидов туляремийного микроба, отдельно биовара japonica голарктического подвида и субпопуляций АI, AII подвида tularensis. Подтверждена ее специфичность при исследовании штаммов туляремийного микроба из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб». Полученные результаты расширяют представление о внутривидовой генетической неоднородности туляремийного микроба и возможности идентификации возбудителя туляремии с помощью молекулярно-генетических методов. Они также важны для понимания процессов приспособления возбудителя к циркуляции в макроорганизме и объектах окружающей среды, направлений эволюции и образования новых видов франциселл.