Полногеномная амплификация малых количеств ДНК для определения молекулярного кариотипа клеток

Задача равномерного масштабирования предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток для молекулярно-генетических исследований потребовала разработки специализированных методов. За 30 лет были предложены разные подходы, базирующиеся на использовании вырожденных праймеров. Однако ограничение методов определяется также свойствами используемых полимераз. В настоящем исследовании предложено использование двухступенчатой полногеномной амплификации для получения надежных данных о молекулярном кариотипе исходного образца на основе анализа 20 пикограммов (пг) ДНК. В протоколе на первом этапе фланкирования фрагментов ДНК и амплификации с вытеснением второй цепи была использована пара частично вырожденных праймеров: 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNGG и 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNTTT, а на втором этапе полимеразной цепной реакции ограничились использованием праймера на основе конститутивной части 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGG. В работе приведены условия реакции и сравнение использования различных полимераз, а также их сочетаний. Показана возможность применения для первого этапа комбинации полимераз Bst и Pfu в присутствии 10 мМ ионов магния, а также выявлен потенциал для использования полимеразы Klentaq1, несущей замену D732N, для развития методов полногеномной амплификации. Продемонстрировано, что предложенный метод позволяет масштабировать исходное предельно малое количество ДНК для получения образца, пригодного для анализа методом массового параллельного секвенирования (секвенирование нового поколения, next generation sequencing, NGS) с применением стандартных коммерческих протоколов интерпретации данных.